酶标仪工作原理

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酶标仪工作原理

酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。

是一种单通道自动进样的酶标仪工作原理图。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光,进入塑料微孔极中的待测标本,该单色光一部分被标本吸收,另一部分则透过标本照射到光电检测器上。光电检测器将透射过待测标本后强弱不同的光信号转换成相应的电信号,电信号经前置放大、对数放大、模数转换等处理后,送入微处理器进行数据处理,转换成相应的浓度,最后由显示器和打印机输出结果。


基本原理

即:酶联免疫吸附剂测定原理:使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而单通道自动进样的酶标仪工作原理图 ,使测定方法达到很高的敏感度。


酶标仪分析原理 

酶标仪酶免疫分析是基于酶催化反应的特性来进行检测和定量分析免疫反应。在实践上,首先要让酶标记的抗体或抗原与相应的配体(抗原或抗体)发生反应,然后再加入酶底物。酶催化反应发生后,可通过检测下降的酶底物浓度或升高的酶催化产物浓度来达到检测或定量分析抗原抗体反应的目的。 

 一、酶免疫分析的基本原理酶是一种能催化化学反应的特殊蛋白质,其催化效力超过目前所有的人造催化剂,一般可使反应加速108一1010倍。此外,酶还具有高度的专一性,即每一种酶只催化一种或一组密切相关的化学反应。EIA是将酶催化的放大作用与抗原、抗体的免疫反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗体或抗原后,既不影响抗体或抗原的免疫反应特异性,也不改变酶本身的催化活性,即在相应的反应底物参与下,标记的酶可以使底物基质水解而呈色,或使供氢体由无色的还原型转变为有色的氧化型,这种有色产物可以通过肉眼、光学显微镜或电子显微镜进行观察,也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了反应体系中酶,即被标记的抗体(或抗原)的存在,从而证明发生了相应的免疫学反应。因此,EIA是一种特异而敏感的检测技术,可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,也可以在微克、甚至纳克水平上对其进行半定量、定量测定。 


 二、酶免疫分析方法中的主要组成部分

(一)固相载体非均相EIA免疫实验所用的固相载体应具备以下条件:

①可结合抗体(抗原)的容量大、种类多;

②可将抗体(抗原)牢固地固定在其表面,虽经长期保存和多次洗涤也不脱落;

③不影响所固定抗体(抗原)的免疫反应性;

④抗体的Fc段(或抗原)被固定在载体上时其与抗原(抗体)的结合空间位点应朝向反应液。常用的材料有:1.塑料如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的微孔反应板(48孔、96孔)或小珠、小试管等产品,是目前应用最广、最普及的一种固相载体,主要通过非共价键吸附抗原或抗体。该类载体的应用可以简化整个EIA的操作步骤,使之易于实现自动化。

2、可磁化颗粒或琼脂糖珠这类固相载体通过共价键结合抗原或抗体,在检测中可分散到整个反应混合液中,有很大的表面积,结合容量较大,因此结合较为有效,使免疫反应得以迅速进行;但制备固相抗体有较严格的技术要求。

(二)包被蛋白经过纯化后,大部分抗原、抗体都可作为ELA反应的包被蛋白。抗原或抗体的浓度高,吸附在载体表面的也越多。

(三)待测样品EIA中的待测样品可以为细胞、血清、脑脊液、胸腹水及其他体液中的任何抗原、抗体,某些反应,如间接法检测丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、竞争抑制法检测乙型病毒性肝炎核心区外型抗体(抗-HBcIgG)等需要对待测样品进行稀释后再进行分析

(四)酶标记物酶标记物是指将酶通过某些化学物(交联剂)和抗原、抗体、Fab片段等蛋白结合在一起的复合物,利用该复合物可以检测相对应的免疫反应原性蛋白。目前常用的交联剂有:戊二醛、氟二硝基苯、过碘酸钠等。

(五)各种缓冲液如:包被液、封闭液、稀释液、洗液、显色底物和缓冲液、终止液等。


酶标仪的工作原理及结构

由酶联免疫吸附实验法可知,酶标仪应该用比色法来分析抗原或抗体的含量,即它应依照比色原理进行工作。实际上,酶标仪就是一台变相的光电比色计或分光光度计,其基本工作原理与主要结构和光电比色计几乎相同。图1是一种单通道、自动进样的酶标仪的工作原理图。 

 

图1 酶标检测仪工作原理图 

 

光源灯发出的光线经过滤光片或单色器后,成为一束单色光束。该单色光束经过塑料微孔板中的待测标本,被标本吸收掉一部分后,到达光电检测器。光电检测器将投射到其上面的光信号的强弱变成电信号的大小。此电信号经前置放大、对数放大、模数转换等模拟信号处理后,送入微处理器进行数据处理和计算。最后由显示器和打印机将测试结果显示、打印出来。 

微处理机还通过控制电路来控制X、Y方向的机械驱动机构的运动。但对于非自动型的酶标仪,它是用手工来移动微孔板的,可以省去X、Y方向的机械驱动机构及其电路,这样的仪器体积更小,结构也更简单。 

微孔板是一种用来盛装待测样本的透明塑料板,板上有多排小孔,如有40孔板、55孔板和96孔板等多种规格。每个小孔可以盛放零点几毫升的溶液。根据仪器的不同,既可以一个孔一个孔地检测,也可以一排孔一排孔地检测。 

酶标仪既可以使用和分光光度计相同的单色器,也可以使用干涉滤光片来获得单色光。和光电比色计一样,使用滤光片作过滤装置时,将滤光片设计到微孔板的前面和后面效果是一样的。 

图2是一种酶标仪的光路系统。光源灯发出的光,经过聚光镜、光阑后,到达反射镜,经反射镜作90o反射后,垂直通过比色液,然后再经滤光片到达光电管。 

 

图2 一种酶标仪光路系统 

 

一般酶标仪的光束既可以设计成从上到下通过比色液,也可以设计成从下到上通过比色。 

由酶标仪的工作原理方框图和光路图可以看出,它和普通光电比色计的不同之处在于:一是盛装比色液的容器不是使用比色皿,而是使用了塑料微孔板,塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作,之所以采用塑料微孔板来作固相载体,是利用它对抗原或抗体有较强的吸附这一特点;二是酶标仪的光束是垂直通过待测液的;三是酶标仪通常不使用A而是使用光密度OD来表示吸光度。 

酶标仪有单通道和多通道两种类型,单通道又分为自动型和手动型两种。其中,自动型的仪器设有X和Y两个方向的驱动机构,在机械装置的驱动下,微孔板上的小孔一个个依次进入光束下面测试。手动型靠手移动微孔板来进行测量。 

在单通道酶标仪的基础上,又发展了多通道、全自动型酶标仪。多通道酶标仪一般都是自动型的,它设有多个光束和多个光电检测器。如8通道的仪器,设有8条光束(或8个光源)、8个检测器和8个放大器。在机械驱动装置的作用下,样品被8个一排、8个一排检测。多通道酶标仪的检测速度快,但其结构比较复杂,价格也较贵,多用于大中型医院。 

酶标仪的其他部分的结构,与光电比色计和小型生化分析仪基本相同


窗体顶端

酶标仪的检测原理

光是电磁波,波长100nm~400nm称为紫外光, 400nm~780nm之间的光可被人眼观察到,大子780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩,是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色,是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下,检测被测物的吸光值。 

  检测单位:

  光通过被检测物,前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量,特定波长下,同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

  检测单位用OD值表示,OD是optical delnsity(光密度)的缩写,表示被检测物吸收掉的光密度,OD=1og(1/trans),其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则,OD值与光强度成下述关系:

E=OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度,Ι0为在检测物之前的光强度,Ι为从被检测物出来的光强度。

  OD值由下述公式计算:

  E=OD=C×D×E

  C为检测物的浓度

  D为检测物的厚度

  E为摩尔因子

  在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长,在此波长下,此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段,就会造成检测结果的不准确。因此,在测定检测物时,我们选择特定的波长进行检测,称为测量波

长。

  但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收,为了消除这种非特异性吸收,我们再选取一个参照波长,以消除这个不准确性。在参照波长下,检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

  Anthos 酶标仪检测值计算

  仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量,转换成二进位数字信号,最大为4095。仪器定义没有光源下的透光值为0%,没有检测物的透光值为100%。则实际检测中,检测物的透光值均在 0%一100%之间。

       透光值的计算如下:

  T=(Meas—Min)/(Max—Min)

  其中T为透光值, Meas为检测的二进位数值,Min为在 0%的情况下检测的二进位数值,Max为在100%的情况下检测的二进位数值,举例如下:

  MaX=3600 Mn=20 Meas=30

  T=(30-20)/3600-20)=0.0028

  OD=1og(1/T)=1og(1/0。0028)=2。552

  Anthos 酶标仪的中心定位

  仪器会自动对酶标孔进行中心定位,中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时,仪器其实要进行35个点的测量,选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。 

  光源的参照通道

  参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。

  酶标仪的用途和其它提示

  用于ELISA试剂的测定,广泛用于各种实验室,包括临床实验室。

  质量控制

  质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制。

  空白校正

  有一些试剂盒的说阴书将空白孔设置为空气,其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的,请按照试剂盒的说明书要求进行。

  检测结果的解释

  由于有相当多的因素会影响检测的结果,如不同的酶标板,检测试剂的体积,都会造成OD值的不同,因此,只有使用同一酶标板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行。

窗体底端


酶标仪的检测原理 

光是电磁波,波长100nm~400nm称为紫外光,400nm~780nm之间的光可被人眼观察到,大子780nm称为红外光。人们只所以能够看到色彩,是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色,是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波长下,检测被测物的吸光值。    检测单位:  

  光通过被检测物,前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量,特定波长下,同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。  

  检测单位用OD值表示,OD是optical delnsity(光密度)的缩写,表示被检测物吸收掉的光密度,OD=1og(1/trans),其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则,OD值与光强度成下述关系:  

    E=OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度,Ι0为在检测物之前的光强度,Ι为从被检测物出来的光强度。

    OD值由下述公式计算:E=OD=C×D×E  C为检测物的浓度 D为检测物的厚度 E为摩尔因子  

  在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长,在此波长下,此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段,就会造成检测结果的不准确。因此,在测定检测物时,我们选择特定的波长进行检测,称为测量波长。  

  但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收,为了消除这种非特异性吸收,我们再选取一个参照波长,以消除这个不准确性。在参照波长下,检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。    Anthos 酶标仪检测值计算  

  仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量,转换成二进位数字信号,最大为4095。仪器定义没有光源下的透光值为 0%,没有检测物的透光值为100%。则实际检测中,检测物的透光值均在 0%一100%之间。透光值的计算如下:  

  T=(Meas—Min)/(Max—Min)  

  其中T为透光值, Meas为检测的二进位数值, Min为在 0%的情况下检测的二进位数值, Max为在100%的情况下检测的二进位数值,举例如下:MaX=3600 Mn=20 Meas=30   T=(30-20)/3600-20)=0.0028   OD=1og(1/T)=1og(1/0.0028)=2.552   Anthos 酶标仪的中心定位  

  仪器会自动对酶标孔进行中心定位,中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时,仪器其实要进行35个点的测量,选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。  

  光源的参照通道  

  参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。 酶标仪的用途和其它提示  

  用于ELISA试剂的测定,广泛用于各种实验室,包括临床实验室。 质量控制

  质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制。 空白校正


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